Chỉ vài tháng sau khi Tôn Dật Tiên chết năm 1925, Tưởng Giới Thạch, với vai trò tổng chỉ huy Quân đội cách mạng quốc gia, tiến hành cuộc Bắc phạt.[10] Tuy vậy, tới năm 1926, Quốc dân đảng đã phân hóa thành phái tả và phái hữu.[10] Những người Cộng sản trong hàng ngũ Quốc dân đảng cũng phát triển mạnh. Tới tháng 3 năm 1926, biến cố tàu Trung Sơn xảy ra, Tưởng đã kịp thời phá vỡ âm mưu bắt cóc mình, và áp đặt lệnh cấm thành viên đảng Cộng sản giữ các vị trí lãnh đạo trong Quốc dân đảng.

Đầu năm 1927, sự tranh chấp Quốc Cộng dẫn tới sự phân liệt trong hàng ngũ cách mạng. Đảng Cộng sản và nhóm cánh tả của Quốc dân đảng quyết định chuyển thủ đô chính phủ Quốc dân từ Quảng Châu về Vũ Hán, nơi đảng Cộng sản có ảnh hưởng mạnh.[10] Nhưng Tưởng Giới Thạch và viên tướng-quân phiệt Lý Tông Nhân, người đánh bại lãnh chúa quân phiệt Tôn Truyền Phương, lại muốn chuyển về Giang Tây. Phe cánh tả bác bỏ đề xuất của Tưởng Giới Thạch, còn Tưởng lên án phe cánh tả "phản bội Chủ nghĩa Tam dân" của Tôn Dật Tiên khi nhận mệnh lệnh từ Quốc tế Cộng sản. Theo Mao Trạch Đông, sự khoan dung của Tưởng Giới Thạch đối với những người cộng sản trong Quốc dân đảng giảm đi khi quyền lực của Tưởng Giới Thạch gia tăng.[11]

Ngày 7 tháng 4, Tưởng và một số lãnh đạo Quốc dân Đảng họp, và đưa ra quan điểm các hoạt động của Đảng Cộng sản làm rối loạn xã hội và kinh tế, và cần phải ngưng lại để cuộc cách mạng quốc gia có thể tiếp tục tiến triển. Kết quả của cuộc họp này là ngày 12 tháng 4, Tưởng Giới Thạch quay ra xử lý những người Cộng sản tại Thượng Hải. Quốc dân Đảng tiến hành thanh trừng khỏi hàng ngũ của mình các thành viên cánh tả, và hàng trăm đảng viên Cộng sản bị bắt giữ hay bị hành quyết.[12] Sự kiện này được gọi tên là "chính biến Thượng Hải", "biến cố ngày 12 tháng 4", hay là "cuộc thảm sát Thượng Hải".[13] Cuộc thảm sát đào sâu thêm hố chia cắt Tưởng và phe Vũ Hán của Uông Tinh Vệ. Đảng Cộng sản định tổ chức giành chính quyền tại một số thành phố lớn như Nam Dương, Trường Sa, Sán Đầu, và Quảng Châu. Đảng viên Cộng sản, cùng với nông dân và thợ mỏ tại Hồ Nam dưới sự lãnh đạo của Mao[14] tiến hành một cuộc nổi dậy, nhưng thất bại.[14] Tại Trung Quốc khi đó tồn tại ba thủ đô, thủ đô được quốc tế công nhận tại Bắc Kinh,[15] Phe Cộng sản và phe cánh tả thuộc Quốc dân đảng đóng thủ đô tại Vũ Hán,[16] và phe cánh hữu Quốc dân đảng đóng đô tại Nam Kinh, thành phố này sẽ tiếp tục đóng vai trò thủ đô của Quốc dân đảng trong suốt một thập kỷ kế tiếp.[15]

Đảng Cộng sản Trung Quốc nay bị trục xuất khỏi Vũ Hán bởi đồng minh của mình là phe cánh tả Quốc dân đảng, nhóm này đến lượt mình lại bị Tưởng Giới Thạch lật đổ. Quốc dân đảng tiếp đó tiếp tục tiến hành cuộc chiến tranh bắc phạt diệt lực lượng quân phiệt và đánh chiếm được Bắc Kinh vào tháng 6 năm 1928.[17] Tiếp đó, phần lớn miền đông Trung Quốc dần rơi vào tay chính quyền Nam Kinh, và chính quyền Quốc dân đảng tại Nam Kinh nhận được sự thừa nhận từ cộng đồng quốc tế như chính phủ hợp hiến duy nhất tại Trung Quốc. Quốc dân đảng tuyên bố nguyên tắc ba giai đoạn cách mạng, phù hợp với cương lĩnh của Tôn Dật Tiên: thống nhất vũ trang, bồi dưỡng chính trị, và dân chủ theo hiến pháp.[18]